单细胞文章再添新物种！近日，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所在FASEB Journal (IF: 5.834，Q1)期刊发表了题为“A single-cell transcriptomic atlas characterizes cell types and their molecular features in yak ovarian cortex”的论文，郭宪研究员为通讯作者、裴杰副研究员为一作，本文构建了牦牛卵巢皮质单细胞图谱，并阐述了牦牛卵巢皮质细胞通讯网络，对于理解适应高原环境的生殖特征及其机制提供了重要依据。

基本信息

材料：牦牛卵巢皮质

期刊：FASEB Journal

发表时间：2022年12月21日

研究内容和目的

哺乳动物卵巢通过产生性激素维持雌性的性特征，释放成熟卵母细胞以供受精并维持妊娠。卵巢是生殖的重要器官，其正常的生物学功能决定了动物的繁殖效率。卵巢的功能依赖于卵巢内不同类型的细胞之间通过细胞衍生的生物分子之间的相互作用而进行的交流。scRNA-seq已帮助多个物种探究其卵巢细胞特征，从而揭示其分子机制。牦牛作为唯一能适应青藏高原恶劣气候条件的牛类动物，是当地人民生产、生活中最重要的物种，但其卵巢分子特征尚不清楚。因此，描绘牦牛卵巢内的细胞分子图谱和细胞通讯有助于理解其适应高原环境的生殖特征及其机制。

内容概述

因此本研究使用scRNA-seq来描绘牦牛卵巢皮质中各种细胞类型的分子特征。通过细胞特异性表达基因鉴定出内皮细胞、NK细胞、基质细胞、平滑肌细胞、卵母细胞、巨噬细胞、上皮细胞和颗粒细胞，使用不同细胞类型的差异基因及其功能富集，构建了牦牛卵巢皮质细胞图谱，同时通过细胞通讯分析构建卵巢皮质细胞间通讯网络。此外，利用卵母细胞的差异基因以及富集分析，将卵母细胞细分为四种亚型，并进行发育轨迹分析。结合牦牛卵巢皮质的免疫荧光结果，确定FST和TOP2A可以作为卵母细胞的marker基因。

综上所述，本文在细胞分子水平上揭示了牦牛卵巢皮质的生物学特性，并通过牦牛卵巢皮质的细胞通讯为雌性生殖生物学研究打下坚实的基础。

具体研究内容解析

1.细胞分群及注释

下机数据经QC质控后共11853细胞进行后续分析，通过PCA降维聚类将所有细胞分为17个细胞群，使用热图展示每个cluster的TOP 5 marker，并使用feactureplot展示9个重点差异基因（图 1a-e）。经过细胞类型鉴定分别鉴定出巨噬细胞、NK细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、基质细胞、颗粒细胞、上皮细胞、卵母细胞8种细胞类型，通过热图展示TOP 6 marker基因，并使用feactureplot、小提琴图及气泡图展示不同细胞类型的marker基因在不同细胞类型中的特异表达（图2a-e）。

图1|牦牛卵巢皮质细胞群分析

图2|牦牛卵巢皮质细胞鉴定

2.不同细胞类型GO、KEGG功能富集

针对不同细胞类型高表达基因进行GO富集分析。不同细胞类型展示了不同的生物学功能，其中内皮细胞主要参与血管生成、内皮细胞凋亡、notch信号通路等，卵母细胞主要表达细胞周期转变、DNA修复及染色体分离过程相关功能，颗粒细胞参与固醇、类固醇、糖皮质激素、雌激素代谢和氧化还原过程等（图 3a）。

上述GO富集结果表明不同类型的细胞参与各自的生物学过程，但是与其已知的生物学功能相符。KEGG富集与GO富集结果一致，同样表明卵母细胞参与卵母细胞减数分裂和细胞周期途径，颗粒细胞参与类固醇生成、胆固醇代谢、类固醇激素生物合成和氧化磷酸化途径等（图 3b）。

图3|牦牛卵巢皮质细胞GO、KEGG富集分析

3.拟时序分析

为探究细胞分化过程中的关键调控靶点，对所有细胞进行拟时序分析，并使用热图展示了不同细胞代表性基因随着分化的进行表达量的变化（图 4a）。不同基因的高表达表明在不同阶段执行着不同的生物学功能。例如卵母细胞标记基因CENPF在整个分化过程中得表达量逐渐下降。这里就要提到到一个知识点，卵子发生经历三个不同的发育阶段：减数分裂开始，围产期卵泡形成，成年卵母细胞生长和成熟。牦牛卵巢皮质内的卵母细胞处于静止状态或生长状态。而CENPF参与调控DNA合成，从而调控细胞周期进程。综上所述，CENPF可能参与了牦牛卵母细胞DNA合成和细胞周期的调控，其功能在分化过程中逐渐减弱。

4.细胞通讯分析

为探究卵巢皮质细胞间通讯关系，使用cellphoneDB对卵巢皮质细胞进行通讯分析（图 4b）。结果表明卵母细胞主要调控基质细胞、颗粒细胞和平滑肌细胞，主要受内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和自身调控。卵母细胞产生大量的配体与基质细胞和颗粒细胞的受体相结合，说明卵母细胞主要调控这两种细胞类型（图 4c，d）。同样卵母细胞产生相对较多的与内皮细胞和自身配体相结合的受体，说明卵母细胞主要由内皮细胞和自身调控（图 4c，d）。

图4|牦牛卵巢皮质细胞间通讯

5.卵母细胞异质性分析

卵母细胞在卵巢皮质中占据重要作用，因此对卵母细胞进行研究。通过小提琴图发现特征基因TOP2A、MIS18BP1、FST和INHA在卵母细胞中的表达水平高于其他细胞类型（图 5a）。因此，将卵母细胞分为4个亚型，并使用气泡图和热图展示没各亚型TOP 5得marker基因（图 5b-e）。为研究卵母细胞得发育轨迹使用monocle2进行拟时序分析，并使用热图分析其基因随发育轨迹表达量的变化，不同基因表达趋势不同（图 5f，h）。其中INHA和FST的表达水平在发育初期上调，发育后期下调，GADD45A在发育中期相对上调，而RAMP2和TOP2A的表达在早期和中期保持中等，后期明显升高（图 5g）。

图5|牦牛卵巢皮质卵母细胞异质性分析

6.HE和免疫荧光实验验证

目前单细胞文章如果想有一个更高的层次普遍需要进行实验验证，验证方式有很多本文的验证方式就可以为其他老师作为参考。本文使用HE和免疫荧光进行验证，结果显示卵母细胞位于卵巢皮质原始卵泡中，每个卵母细胞在腔前卵泡中被少量颗粒细胞前体细胞包围（图 6a）。通过免疫荧光技术来确定scRNA-seq是否准确地筛选了卵母细胞的特异性表达基因。如免疫荧光切片所示，卵母细胞的蛋白FST和TOP2A在原始卵泡中鉴定出，表明这两种蛋白的表达都位于卵母细胞的细胞质中（图 6b，c）。静止状态卵母细胞中FST的表达水平高于生长状态卵母细胞。综上所述，免疫荧光结果与scRNA-seq结果保持一致，确定了数据的准确性。

图6|牦牛卵巢皮质HE染色及免疫荧光验证

总结

1.构建了牦牛卵巢皮质单细胞图谱，并阐述了牦牛卵巢皮质细胞通讯网络；

2.确定FST和TOP2A可以作为卵母细胞的marker基因。

Pei J, Xiong L, Guo S, et al. A single‐cell transcriptomic atlas characterizes cell types and their molecular features in yak ovarian cortex[J]. The FASEB Journal, 2023, 37(1): e22718.

https://doi.org/10.1096/fj.202201176RR

单细胞转录组助力构建牦牛卵巢皮质单细胞图谱